Detección y caracterización de virus epidemiológicamente relevantes en cultivos de tomate y cucurbitáceas

Resumen

El tomate y las cucurbitáceas se encuentran entre las hortalizas cultivadas más importantes y España es uno de sus principales productores mundiales. Las virosis suponen una seria amenaza pare estos cultivos y pueden llegar a producir importantes pérdidas económicas a nivel mundial. Dada la dificultad para controlar las enfermedades virales, es esencial disponer de técnicas de detección adecuadas que permitan, no sólo monitorizar el desarrollo de una enfermedad, sino implementar adecuadamente medidas preventivas y de contención. El empleo de variedades resistentes y la utilización de material vegetal libre de virus se encuentran entre las principales medidas de protección contra las virosis. En este contexto se ha desarrollado el trabajo de esta tesis, que está estructurada en dos capítulos. En el primer capítulo se describe un estudio epidemiológico en torno a brotes epidémicos agresivos atribuibles a la enfermedad del rizado amarillo del tomate (Tomato yellow leaf curl disease, TYLCD) en plantas de tomate portadoras de los genes de resistencia a TYLCV, realizado durante los años 2015 y 2016 en Murcia y durante el año 2017 en Almería. Utilizando técnicas de secuenciación masiva (2015) y clonaje y secuenciación de tipo Sanger (2016 y 2017), se determinaron un total de 28 secuencias de TYLCV completas. Los análisis filogenéticos realizados mostraron que todas las secuencias obtenidas pertenecían a aislados de TYLCV de la cepa Israel (TYLCV-IL, familia Geminiviridae, género Tobamovirus). Un primer análisis realizado con las secuencias de 2015 y 2016 mostró la existencia de dos grupos de aislados, uno emparentado con aislados de la cepa Israel antiguos en la zona, y otro grupo, de reciente introducción, emparentado con aislados recombinantes marroquíes, denominados TYLCV-IS76. Un clon infectivo generado a partir de una de las secuencias de este segundo grupo fue utilizado en un ensayo de eficacia biológica frente a un clon de TYLCV-IS76, en el que se observó que en infección mixta predominó IS76, mientras que en infección simple el aislado murciano aventajó al recombinante. En el análisis de las secuencias de 2017, se identificó por primera vez la presencia de aislados del tipo TYLCV-IS76, siendo la única evidencia de aislados recombinantes de este tipo identificados fuera de Marruecos. En el segundo capítulo de esta tesis se describe la puesta a punto de la técnica de RT-qPCR combinada con sondas TaqMan para la detección de 3 virus de cucurbitáceas transmitidos por semilla, el virus del mosaico jaspeado verde del pepino (cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV; familia Virgaviridae, género Tobamovirus), el virus del mosaico de la calabaza (squash mosaic virus, SqMV; familia Secoviridae, género Comovirus) y el virus de las manchas necróticas del melón (melon necrotic spot virus; familia Tombusviridae, género Gammacarmovirus), y su comparación con la técnica de ELISA, que es la principal técnica utilizada en los análisis de certificación. Con esta técnica se pudo detectar a los tres virus con una gran sensibilidad y especificidad, abriendo la posibilidad a la realización de análisis múltiples. La comparación con la técnica ELISA, realizada únicamente con semillas infectadas con SqMV y CGMMV, mostró una sensibilidad superior, a nivel de lote de semilla y a nivel de límite de detección, demostrándose su idoneidad para la utilización en análisis de semilla. En conjunto, los resultados de esta tesis han permitido, por un lado, proporcionar información sobre la situación actual de las epidemias de TYLCV en España, y, por otro lado, diseñar un método rápido y sensible para la detección de 3 virus transmitidos por semilla en cucurbitáceas, abriendo la posibilidad de su implementación en futuros programas de certificación.